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酶标记免疫电镜技术,酶标记抗体的制备技术

核心提示:酶标抗体的条件 1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。 2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只酶标抗体的条件 1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。 2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。 3.效价高一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。 酶标记方法 1.交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。 戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 ⑴一步法:即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大,酶分子量小,抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP 的制备:将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/LpH7.0PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛,4℃保存备用;②抗IgG-HRP的制备:将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充分透析或以 SephadexG25除戊二醛,小量分装后保存于低温冰箱,避免反复冻融。或冷冻干燥保存。 ⑵二步法:是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作:将10mg的酶溶于0.2ml含 1.25%戊二醛的0.1mol/LpH6.8PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至 1ml然后加入1ml的抗体溶液和1ml1Mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液,混合后4℃冰箱放置24h,加入0.1ml0.2mol /L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/LpH7.2PBS液充分透析,离心去沉淀,上清液即为酶结合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。 AKP一般不采用二步法,而只用一步法。 改良HRP二步标记法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/LpH6.8PBS液中或0.05Mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml,37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml,2500r /min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用 1ml0.05Mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液溶解,加入0.5ml~1ml抗IgG抗体溶液,放在冰箱内过夜后,加KH2PO4,使近中性即可应用。 2.氧化法采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。 氧化法操作过程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1ml1%氟二硝基苯无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠,置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在4℃中对0.10Mol /LpH9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。在3mlHRP-醛基溶液中,加入5mg,室温置2h~3h,加入 5mg氢化硼钠,于4℃冰箱放置3h或过夜,然后用PBS液充分透析,离心去沉淀物。上清液即为酶结合物,纯化后使用。 改良过碘酸钠法:①取5mgHRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/LNaIO4水溶液0.5ml,混匀,置4℃30min;②取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30min;③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h,使之结合;④加入NaBH4溶液0.2ml,混匀,置4℃2h;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/LpH7.4PBS液溶解,装入透析袋,以同样液体在4℃透析除盐过夜;⑥次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体结合物,以0.02Mol/LpH7.4PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后,加入等量优质甘油,分装小瓶,低温保存。 戊二醛交联法与过碘酸钠氧化法比较,见表12-3。 表12-3戊二醛法与过碘酸钠法比较3.二马来酰亚胺法二马来酰亚胺能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α-巯基乙胺还原蛋白质,并用N、 N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。具体操作如下:将抗lgG抗体溶于 0.1Mol/LpH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG与10mlα-巯基乙胺在 37℃温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘-O-苯二马来酰亚胺溶液,混合,于30℃温育20min,过SephadexG25柱,除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0,取1ml溶液加20μlβ-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/LNaOH中和后,于4℃置 24h~72h,再过Sepharose-6B柱,以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物,加叠氮钠防腐,4℃保存备用。 酶标抗体结合物的纯化 在酶标记的溶液中,出现的是各种交联物的混合物,有酶-抗体、酶-抗体-酶、抗体-抗体、酶-酶,甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体-酶和酶-抗体-酶外,其它都应该给予除去。 1.50%饱和硫酸铵沉淀法。此法只能除去游离的酶及酶-酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。 2.过SephadexG200或Sepharose-6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。 酶标抗体的鉴定 1.酶标抗体的活性鉴定一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1:16以上。 2.酶结合物的定量测定包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。。 ⑷酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。 ⑸酶标记率:OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度与抗体-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度之比表示HRP在AbE中所占的比例,它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。 3.酶结合物的质量标准纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。 酶的催化活性。 免疫学活性。 未联接的游离酶的量。 未联接的原始免疫反应物的量。 每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。 生化性质。 酶标记免疫试验效果。 酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRP-IgG结合物进行酶标记免疫试验,可得到不同的试验结果,故应予重视。 用于ELISA的各项指标参数见表12-40 表12-4用于ELISA酶标抗体的各项指标参数

核心提示:将酶和抗体结合,这种酶-抗体结合物仍然保持酶和抗体的活性及特异性,结合物中的抗体与相应组织或细胞内的抗原特异性结合,形成

评价

最好

一般

酶结合量

≥1.0

≥0.5

0.4

酶结合率

>30

9~10

7

酶IgG克分子比

>1.5

1.0

0.7

将酶和抗体结合,这种酶-抗体结合物仍然保持酶和抗体的活性及特异性,结合物中的抗体与相应组织或细胞内的抗原特异性结合,形成不溶性复合物,然后通过酶的底物显示酶的活性部位,酶反应产物经过OsO4处理后变为具有一定电子密度的锇黑,可在电镜下观察,从而对抗原进行定位,这种方法叫酶标记免疫电镜技术。目前,用于标记抗体的酶有辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、细胞色素C、微过氧化物酶等,但最常用的是HRP,其稳定性好,分子量小,其标记抗体可以穿透经适当处理的组织与细胞膜,能用于细胞内抗原定位。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高。

酶标抗体的保存分装小瓶,冻干低温保存。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白保存更好。避免反复冻融。保存期:一般1~2年活性不变。

辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉辅基结合而成的一种糖蛋白,糖类的含量占18%。商品一般在不同程度上含有非酶蛋白。它的纯度用RZ(德文Reinheit Zalt的缩写)来表示。辣根过氧化物酶的辅基在403nm波长下呈最大吸收,通常用OD403nm数值反应酶的含量。酶的蛋白部分在OD275nm下吸收最强。RZ即OD403nm/OD275nm的值。RZ值越小表示非酶蛋白越多。高纯度的酶制品RZ应为3.0左右,最高可达3.4。免疫电镜需用高纯度的酶。酶的纯度与其活性强度不一定平行,所以酶的规格除纯度外,还应包括活性强度。

酶标记抗体法

标记的前提是保留抗体与酶的部分活性,保留越多越好。目前有两类标记法。

双功能剂偶联法:

最常用的双功能剂是戊二醛。它的两个醛基能与抗体和HRP的氨基或羟基结合,而使二者偶联在一起。常用二步标记法,即第一步先使戊二醛的一个醛基与HRP的氨基结合,第二步再使戊二醛的另一个醛基与抗体的氨基结合。用此法所得的HRP-抗体结合物中,HRP与抗体皆为单体,分子量为200kD左右,抗体与酶活性保存60%左右,缺点是结合率不高。戊二醛二步法(AVrameas-Ternyck法,)具体操作步骤为:取辣根过氧化物酶10 mg溶于0.1 mol/L PBS中,配成含1.25%戊二醛溶液0.2 ml,室温放置18h。用生理盐水透析或经葡聚糖凝胶G-25除去戊二醛,用生理盐水补充至l ml。加入含5 mg抗体的生理盐水溶液l ml和l mol/L碳酸盐缓冲液0.1 ml,混匀后在4℃放置24h。 加0.1 ml 0.2 mol/L赖氨酸溶液,室温中放置2h。用半饱和硫酸铵沉淀三次,透析除去硫酸铵,离心(1000 rpm,30min),取上清分装冻存,或加入等量60%甘油的PBS,4℃贮存。用前1 mg蛋白加入1 mg小白鼠肝粉末吸收,除去非特异反应物质。

过碘酸盐氧化标记法:

HRP中的氨基含量很少,用戊二醛交联虽方法简便,但结合物产率很低,一般只有2%~5%的酶能结合IgG上。与氨基相反,HRP上的糖蛋白却较多,约18%。糖分子对酶的活性影响不大,但难以直接与抗体的氨基进行反应,所以,用过碘酸钠使糖进行轻微氧化,产生醛基,后者再与抗体的氨基反应。这样,HRP就能更有效地与抗体结合。将5 mg辣根过氧化物酶溶于l ml 0.3mol/L碳酸氢钠溶液中,加0.1 ml 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液,室温轻轻搅拌1h。加lml 0.04~0.08mol/L过碘酸钠,搅拌30 min后,溶液呈黄绿色。再加l ml0.16mol/L乙二醇,继续搅拌1h。对1000 ml 0.01mol/L的碳酸盐缓冲液充分透析4℃,其间换缓冲液三次。加入含5mg IgG的碳酸盐缓冲液lml,室温轻搅2~3h。加入5mg NaBH4,置4℃3小时或过夜。对PBS透析24h,4℃离心去沉淀,用半饱和硫酸铵沉淀结合物三次,除铵、分装、保存。

酶标记免疫电镜技术,酶标记抗体的制备技术。不标记抗体酶法

酶桥法:

Mason等与Sternberger同时报道了免疫球蛋白-酶桥法(又称夹心法或三层法)。其原理主要是利用第二抗体为桥梁,把抗原的特异性抗体与抗HRP抗体结合起来,后者再与HRP结合。HRP与其抗体形成复合物后仍保留其酶活性,可加底物显色,达到定位抗原的目的。由于在抗HRP血清中除酶抗体外,还含有非酶抗体,后者与酶抗体竞争在第二抗体上的结合点,所以抗HRP抗体必须效价高,才能保证此法的高灵敏性。为此要耗费较多的纯HRP来制备抗HRP血清。

PAP法与双PAP法:

为了改进酶桥法,Sternberger等人又建立了可溶性酶-抗酶 抗体复合物法。他们制备了可溶性兔PAP来代替酶桥法中的最后两个步骤,即兔抗HRP抗体与自由HRP两步。此法既可纯化酶抗体以提高方法的灵敏性,又可简化酶桥法繁多的步骤。可溶性兔PAP是大分子的复合物,含有三个分子HRP与两个抗HRP抗体,外形呈五角形,分子量429 kD,直径20.5nm。Vacca等提出了双PAP法,既在用PAP处理组织或细胞后,重复使用一次羊抗兔IgG和PAP,最后显色。这样可比单纯的PAP法提高灵敏性4~5倍。在用单克隆抗体做第一抗体定位抗原是,桥抗体需用羊抗鼠IgG取代羊抗兔IgG,兔PAP需用鼠PAP取代。继Terngnek之后,程明在国内首先制备了鼠PAP,后者是用抗HRP的单抗隆抗体与HRP共育而制成,产物为一个抗体分子结合两个酶分子,分子量比兔PAP小很多。

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